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感染性疾病作為全球公共衛(wèi)生的重大挑戰(zhàn)，其導(dǎo)致的死亡占全球總死亡人數(shù)的1/3以上，嚴(yán)重威脅人類健康與公共衛(wèi)生安全。病毒載量作為評(píng)估病原體復(fù)制活性、疾病進(jìn)展程度及治療效果的核心指標(biāo)，在感染性疾病診療中具有不可替代的作用，例如HIV病毒載量監(jiān)測(cè)可直接指導(dǎo)抗病毒治療方案調(diào)整，HBV病毒載量動(dòng)態(tài)變化與肝硬化、肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。

傳統(tǒng)檢測(cè)方法如病原體培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)等存在耗時(shí)久、靈敏度低、難以定量等局限性，無(wú)法滿足現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“早診斷、準(zhǔn)治療、快防控”的需求。熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)核酸擴(kuò)增過(guò)程中的熒光信號(hào)變化，實(shí)現(xiàn)了病原體核酸的定性與定量分析，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)快速等優(yōu)勢(shì)，已成為臨床病毒載量監(jiān)測(cè)的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。博清生物科技（南京）有限公司自主研發(fā)的BOD-16PE熒光定量PCR儀，融合了實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)精準(zhǔn)溫控技術(shù)與多通道熒光檢測(cè)系統(tǒng)，針對(duì)移動(dòng)檢測(cè)、現(xiàn)場(chǎng)篩查等場(chǎng)景進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，兼具高通量與便攜性特點(diǎn)。

一、材料與方法

（一）儀器與試劑

試驗(yàn)儀器：博清生物熒光定量PCR儀（型號(hào)BOD-16PE），配備7寸觸控屏、4 色熒光檢測(cè)通道，16孔反應(yīng)模塊；對(duì)照儀器為某品牌熒光定量PCR儀。

試驗(yàn)試劑：HBV、SARS-CoV-2、HIV核酸檢測(cè)試劑盒（含引物、TaqMan探針、反轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶等）；病毒核酸提取試劑盒（磁珠法）；系列濃度病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品（102~10? copies/μL）。

（二）試驗(yàn)方法

1、檢測(cè)體系建立

按照試劑盒說(shuō)明書配置25μL PCR反應(yīng)體系：2×qPCR Mix 12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，熒光探針（10μmol/L）0.3μL，模板核酸5μL，無(wú)酶純水補(bǔ)至25μL。反應(yīng)程序設(shè)置：逆轉(zhuǎn)錄（針對(duì)RNA病毒）42℃ 15min，預(yù)變性95℃ 3min；95℃ 10s，60℃ 30s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號(hào)。

2、靈敏度檢測(cè)

將HBV、SARS-CoV-2、HIV標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行10倍梯度稀釋，濃度范圍為101~10? copies/μL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。采用博清生物熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，以3個(gè)復(fù)孔均能檢出熒光信號(hào)且Ct值穩(wěn)定的最低濃度為最低檢測(cè)限（LOD）。

3、線性范圍與擴(kuò)增效率分析

取102~10?copies/μL的系列標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行qPCR檢測(cè)。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)（R2）；根據(jù)公式E=（10^(-1/slope)-1）×100%計(jì)算擴(kuò)增效率，其中slope為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

4、重復(fù)性分析

選取中（10?copies/μL）、高（10?copies/μL）兩個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度設(shè)置8個(gè)復(fù)孔，在同一批次內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)（批內(nèi)重復(fù)性）；連續(xù)5天重復(fù)檢測(cè)同一濃度標(biāo)準(zhǔn)品（批間重復(fù)性），計(jì)算Ct值的變異系數(shù)（CV），CV=（標(biāo)準(zhǔn)差/平均值）×100%。

二、結(jié)果

（一）靈敏度檢測(cè)結(jié)果

博清生物熒光定量PCR儀對(duì)HBV、SARS-CoV-2和HIV的最低檢測(cè)限分別為10copies/μL、15copies/μL和20copies/μL，均低于臨床常規(guī)檢測(cè)閾值（50copies/μL），能夠有效檢出低載量病毒樣本。

（二）線性范圍與擴(kuò)增效率

在102~10?copies/μL濃度范圍內(nèi)，三種病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)（R2）均≥0.995，擴(kuò)增效率為90.2%~104.8%，符合臨床定量檢測(cè)要求。典型標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示，Ct值與病毒核酸起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈良好線性關(guān)系。

（三）重復(fù)性分析結(jié)果

批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)中，中、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值變異系數(shù)（CV）均＜3%；批間重復(fù)性試驗(yàn)中，CV值均＜5%，表明博清生物熒光定量PCR儀的檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性良好。

（四）臨床樣本驗(yàn)證結(jié)果

120例臨床樣本中，博清生物熒光定量PCR儀與對(duì)照熒光定量PCR儀的檢測(cè)總符合率為96.7%（116/120），其中HBV樣本符合率 95.0%（38/40），SARS-CoV-2樣本符合率 97.5%（39/40），HIV樣本符合率97.5%（39/40）。Kappa檢驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種儀器的Kappa值為0.94，一致性極強(qiáng)。

三、討論

病毒載量監(jiān)測(cè)是感染性疾病精準(zhǔn)診療的核心環(huán)節(jié)，其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性直接影響治療方案制定、療效評(píng)估及預(yù)后判斷。熒光定量PCR技術(shù)作為病毒載量檢測(cè)的主流方法，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)與核酸擴(kuò)增的同步關(guān)系，實(shí)現(xiàn)了對(duì)病毒核酸的精準(zhǔn)定量，其性能優(yōu)劣取決于儀器的溫控精度、光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)靈敏度及軟件數(shù)據(jù)處理能力。

本研究結(jié)果顯示，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光定量PCR儀在病毒載量監(jiān)測(cè)中表現(xiàn)出優(yōu)異的性能：其一，靈敏度高，對(duì)HBV、SARS-CoV-2和HIV的最低檢測(cè)限分別低至10、15和20copies/μL，能夠有效捕捉感染初期或治療后低載量殘留病毒，為“功能性治愈”評(píng)估提供技術(shù)支持，這一性能與進(jìn)口儀器相當(dāng)，且滿足WHO對(duì)病毒載量檢測(cè)的靈敏度要求；其二，線性范圍寬（102~10?copies/μL），相關(guān)系數(shù)≥0.995，擴(kuò)增效率穩(wěn)定在90%~105%，確保了不同濃度病毒樣本檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，尤其適用于病毒復(fù)制活躍期高載量樣本與治療后低載量樣本的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)；其三，重復(fù)性良好，批內(nèi)與批間CV值均＜5%，符合臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，避免了因檢測(cè)波動(dòng)導(dǎo)致的診療誤判；其四，臨床一致性強(qiáng)，與進(jìn)口儀器的總符合率達(dá)96.7%，Kappa值0.94，表明該儀器可有效替代進(jìn)口設(shè)備用于臨床常規(guī)病毒載量檢測(cè)。

除核心檢測(cè)性能外，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光定量PCR儀的設(shè)計(jì)優(yōu)勢(shì)進(jìn)一步拓展了其應(yīng)用場(chǎng)景。該儀器采用7寸觸摸屏與菜單式導(dǎo)航界面，無(wú)需連接PC即可獨(dú)立操作，降低了對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的要求；16孔反應(yīng)模塊兼容八連排管與單管，兼顧了檢測(cè)通量與樣本靈活性；體量輕盈的便攜設(shè)計(jì)使其適用于移動(dòng)實(shí)驗(yàn)室、現(xiàn)場(chǎng)篩查等場(chǎng)景，在突發(fā)疫情防控中具有重要價(jià)值。此外，該儀器采用長(zhǎng)壽命免維護(hù)LED光源與4色熒光檢測(cè)通道，可滿足多種病原體聯(lián)合檢測(cè)需求，如呼吸道多病毒同步篩查，符合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“一站式檢測(cè)”的發(fā)展趨勢(shì)。

當(dāng)前，病毒載量檢測(cè)面臨的主要挑戰(zhàn)包括低拷貝樣本定量準(zhǔn)確性、抑制物干擾及檢測(cè)時(shí)效性等問(wèn)題。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光定量PCR儀通過(guò)優(yōu)化溫控系統(tǒng)（快速升溫速率與精準(zhǔn)控溫精度）減少了非特異性擴(kuò)增，結(jié)合TaqMan探針的特異性識(shí)別，有效降低了樣本抑制物的干擾；檢測(cè)全程僅需2~3小時(shí)，較傳統(tǒng)培養(yǎng)方法（3~7天）大幅縮短了檢測(cè)時(shí)間，為感染性疾病的早期診斷與及時(shí)治療提供了保障。

本研究的局限性在于樣本量相對(duì)有限，且未涉及罕見(jiàn)病原體及變異株的檢測(cè)性能評(píng)估。未來(lái)可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本規(guī)模，探討該儀器在耐藥基因聯(lián)合檢測(cè)、新型病原體篩查中的應(yīng)用；同時(shí)可結(jié)合數(shù)字PCR技術(shù)，優(yōu)化低拷貝樣本的定量算法，進(jìn)一步提升檢測(cè)精度。

綜上所述，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光定量PCR儀在病原體核酸定量檢測(cè)與病毒載量監(jiān)測(cè)中表現(xiàn)出高靈敏度、高特異性、良好重復(fù)性及臨床一致性，且具備便攜操作、高效快速等優(yōu)勢(shì)，為感染性疾病的診療與防控提供了可靠的國(guó)產(chǎn)技術(shù)方案，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。